体内细胞培养及操作步骤

1、瘤细胞悬液接种

（1）无菌选取生长良好(有光泽，淡红色)瘤组织或对数生长期培养瘤细胞。

（2）在PBS中将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨，经80～100目筛网过滤成细胞悬液。

（3）培养细胞应用PBS洗两遍。

（4）计数并调整细胞浓度至107～108／ml。

（5）常规消毒后，于接种部位(通常为背部或腋窝腹股沟皮下)用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液(0.1ml／部位，＞106细胞)。初次接种成功率低，细胞数尽可能多一些。

（6）次日注意观察动物一般情况。初次接种一般有一段较长的潜伏期，以后随着传代潜伏期逐渐缩短，最后固定为一个相对稳定的时间。

2、腹水瘤的建立与腹水瘤的接种　将实体瘤细胞直接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤细胞，将这种腹水反复传代，即可成为腹水瘤。初次传代时，腹水常呈血性(含大量红细胞)，反复传代后腹水逐渐变成乳白色。腹水瘤的接种过程如下。

（1）将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤，进行细胞计数。

（2）消毒动物，左下腹穿刺接种106腹水瘤细胞。

（3）接种腹水瘤细胞后约7~12d，待小鼠腹部明显膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9号针头抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。

（4）抽取的腹水经3000rpm离心15min，收集上清，分装冻存备用。

四、培养细胞的冻存及复苏

原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。

1、冻存细胞：

（1）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1d换液。

（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×107／ml左右密度，离心，去上清。

（3）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。

（4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液。

（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。

（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。

操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。

2、复苏细胞：

（1）从罐中取出冻存管。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。

（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

（4）低速离心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培养液洗一次。

（5）用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。

冻存细胞数量要充分，密度应达到107／ml，在融后稀释20倍时，仍能保持5×105／ml数量。