通用型细菌16S rDNA 荧光定量PCR扩增检测试剂盒产品说明书

主要用途

通用型细菌16S rDNA 荧光定量PCR扩增检测试剂是一种旨在运用SYBR绿色荧光染料作为标记信号，针对微生物样本DNA进行保守性序列PCR扩增，实时检测和定量分析扩增产物的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于各种样品，包括血液、体液、组织、土壤等的细菌拷贝数的定量检测。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量准确，重复性强。

技术背景

16SrRNA作为非培养依赖性标记的分子指模（fingerprinting）技术，有别于传统的选择性培养技术，用于研究微生物的分类学（phylogenetics）。核糖体RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物体内，且结构与功能进化保留；容易分离和识别；其一级和二级结构具有高度进化保守区域（conserved region）和物种特异性可变区域（variable region）；其基因序列变异非常缓慢，且不会发生平行基因转移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不够充分；23S不稳定；而微生物16SrRNA基因较为稳定，初级结构含有1500个碱基。通过引物设计，扩增产物。SYBR绿色荧光染料，作为DNA结合染料，可以和扩增子（amplican）上双链DNA的任一小沟（minor groove）结合，而发出荧光信号。根据每一循环的荧光强度来确定扩增产物的产量，并用循环阈值（threshold cycle；Ct）表示，计算获得拷贝数。

产品内容

反应液（Reagent A）          300微升

染色液（Reagent B）           20微升

引物液（Reagent C）              40微升

补充液（Reagent D）          500微升

封隔液（Reagent E）          1.5毫升

产品说明书                 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent B）避免光照；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品预处理的容器

1.5毫升离心管：用于预处理的容器

（微型）台式离心机：用于样品处理

PCR管：用于样品扩增操作的容器

荧光定量PCR仪：用于荧光定量PCR反应

实验步骤

实验开始前，从－20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作：

1． 一次反应总量为25微升

2． 移取15微升反应液（Reagent A）到0.5毫升PCR管

3． 加入5微升待测的DNA模板（或 100纳克）

4． 加入1微升染色液（Reagent B）

5． 加入2微升引物液（Reagent C）

6． 加入3微升补充液（Reagent D）至总容量为25微升

7． 放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒

8． 使用1000微升枪头加入1滴封隔液（Reagent E）（注意：参见注意事项10）

9． 即刻放进荧光定量PCR仪

10． 荧光定量PCR反应程序为：

温度（℃）

时间

循环

95

2分钟

1

95

55

72

30秒

90秒

60秒

40

72

5分钟

1

11． 进行数据分析

（1） 采用比较阈值分析法（ΔΔCt），即相对定量，计算样品拷贝数：建议使用用户自备的对照样品或大肠杆菌细菌株

（2） 或采用标准曲线法，即绝对定量，计算样品拷贝数

（3） 细菌量单位计算：拷贝数/毫升样品（copies/ml）或拷贝数/微克样品DNA（copies/µg）

A） 根据上述方法获得待测样品拷贝数（Q）

B） 根据下列公式计算单位拷贝数，即拷贝数/毫升样品（copies/ml）或拷贝数/微克样品DNA（copies/µg）

C：单位拷贝数

Q：待测样品拷贝数

VDNA：DNA萃取后的总容量

VPCR：反应体系中DNA模板容量（5微升）

VEXT：原始样品总容量

注意事项

1． 本产品为20次PCR反应

2． 操作时，须戴手套

3． 样品操作注意生物安全

4． 本产品适合各种荧光定量PCR仪

5． 建议整个操作在4℃下进行

6． 建议使用带滤芯的枪头，避免交叉污染

7． 使用时，避免污染母液