巴贝斯虫（Bab）核酸检测试剂盒说明书

通用名称：巴贝斯虫（Bab）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name：Babesia Canis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

巴贝斯虫病是一种蜱传性的血液原虫病，该病由寄生于红细胞内的多种巴贝斯虫引起，其临床特征为发热、精神沉郁、嗜睡、黄疸、贫血、血红蛋白尿、呕吐、呼吸困难等，对犬的健康造成了巨大的危害。[1-2]

本试剂盒适用于检测血液中的巴贝斯虫，用于巴贝斯虫感染的辅助诊断。

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对巴贝斯虫基因组特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对巴贝斯虫基因组的 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

包装规格

50T/盒

Bab 反应液

500μL×2 管

酶液

50μL×1 管

Bab 阳性质控品

50μL ×1 管

阴性质控品

250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

无菌注射器抽取血液 3~5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入

1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；咽拭子样品直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按    照试剂说明书进行操作。

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满

10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂

Bab 反应液

酶液

用量（样本数为 N）

20μL

1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择

ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

步骤

循环数

温度

时间

收集荧光信号

1

1 cycle

95℃

10min

否

2

40 cycles

94℃

15sec

否

55℃

30sec

是

5.1 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的

Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

1. 所有操作严格按照说明书进行；

2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3. 反应液应避光保存；

4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

[1] 李蓓蓓.犬巴贝斯虫病的诊断与预防[J].今日畜牧兽医,2019,35(03):99.

[2] 陕西省部分宠物医院犬巴贝斯虫病流行情况及病原鉴定[D]. 唐欢.西北农林科技大学，2019.

蜱传性的血液原虫病，该病由寄生于红细胞内的多种巴贝斯虫引起，其临床特征为发热、    精神沉郁、嗜睡、黄疸、贫血、血红蛋白尿、呕吐、呼吸困难等，对犬的健康造成了巨大的危害。[1-2]