主要用途

活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氯荧光乙酰乙酸盐，在组织氧化损伤条件下，产生荧光，来定量检测组织内活性氧族的生成和增加的较好而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适宜于活体动物组织的分析。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。2',7'-二氯荧光乙酰乙酸盐（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一种完全自由通过细胞膜的染色剂。一旦被过氧化氢、过氧化基、过氧亚硝基阴离子等氧化，便产生绿色荧光。据此测定组织细胞内活性氧族的浓度。

产品内容

清理液（Reagent A）

300毫升

染色液（Reagent B）

1毫升

稀释液（Reagent C）

200毫升

说明书

1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证12月

用户自备

50毫升锥形离心管：用于组织收集的容器

15毫升锥形离心管：用于工作液配制和组织处理的容器

1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器

6孔细胞培养板：用于组织染色的容器

培养箱或恒温水槽：用于染色孵育

荧光显微镜：用于观察荧光组织

荧光分光光度仪：用于组织荧光定量检测

实验步骤

方法一：新鲜组织薄片定性检测

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出25微升染色液（Reagent B）到新的15毫升锥形离心管，加入2.5毫升稀释液（Reagent C)，混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后进行下列操作。

1． 手术取出动物组织

2． 放进预冷的50毫升锥形离心管

3． 加入3毫升清理液（Reagent A）浸泡15秒

4． 用镊子取出组织，用无菌绵纸吸干

5． 即刻用刀片切离组织为1cm X 1cm大小的片状组织

6． 用镊子将组织薄片放进6孔培养板的一个孔

7． 加入2.5毫升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液

8． 放进37℃培养箱孵育20分钟，避免光照（注意：如果组织薄片较厚，可以增加孵育时间至60分钟）

9． 小心抽去染色工作液

10．加入3毫升清理液（Reagent A）

11．用镊子将组织薄片放在载玻片上

12．压片

13．即刻在荧光显微镜下观察（定性检测）：激发波长490nm，散发波长520nm――绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高

方法二：组织匀浆定量检测

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出25微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入990微升稀释液（Reagent C)，混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后进行下列操作。

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量

2． 移取1克组织，放进预冷的50毫升锥形离心管

3． 加入3毫升的清理液（Reagent A）

4． 用镊子取出组织，用无菌绵纸吸干

5． 即刻用刀片切碎组织

6． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

7． 加入5毫升预冷的稀释液（Reagent C）

8． 涡旋震荡5秒，充分混匀

9． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

10．在冰槽里用研磨棒匀化组织（注意：切莫过度匀化）

11．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

12．置入冰槽里备用

13．移取5微升组织匀浆物进行蛋白定量检测

14．移取50微升组织匀浆物（样品）或50微升稀释液（Reagent C）（背景对照）到1毫升石英比色杯里

15．加入950微升升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液

16．上下倾倒混匀

17．放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照

18．即刻放进荧光分光光度仪检测：激发波长490nm，散发波长520nm——（样品RFU-对

方法三：组织匀浆微量检测

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入200微升稀释液（Reagent C)，混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后进行下列操作。

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量

2． 移取200毫克组织，放进预冷的15毫升锥形离心管

3． 加入1毫升的清理液（Reagent A）

4． 用镊子取出组织，用无菌绵纸吸干

5． 即刻用刀片切碎组织

6． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

7． 加入1毫升预冷的稀释液（Reagent C）

8． 涡旋震荡5秒，充分混匀

9． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

10．在冰槽里用研磨棒匀化组织（注意：切莫过度匀化）

11．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

12．置入冰槽里备用

13．移取5微升组织匀浆物进行蛋白定量检测

14．移取50微升组织匀浆物（样品）或50微升稀释液（Reagent C）（背景对照）到1毫升石英比色杯里

15．加入200微升升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液

16．上下倾倒混匀

17．放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照

18．即刻放进荧光酶标仪检测：激发波长490nm，散发波长520nm——（样品RFU-对照RFU）＝实际RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事项

1． 本产品为20次（1克组织）、100次（200毫克组织）、500次（200毫克组织，酶标板）或40次（组织薄片）操作

2． 建议使用新鲜组织，手术切除后1小时内的样品

3． 操作时，须戴手套

4． 孵育时，须避免光照

5． 如果组织薄片较厚，可以增加孵育时间至60分钟

6． 组织匀浆时，切莫过度

7． 建议组织染色完成后，即刻进行荧光定量或定性分析

8． 本公司提供阳性对照甲萘醌溶液，观察组织荧光增强现象

9． 本公司提供系列活性氧检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰