细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

01

实验前准备

将水浴锅提前预热至37℃

细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。

在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

02

取出冻存管

根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

03

迅速解冻

迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

04

平衡离心

用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

05

制备细胞悬液

吸弃上清液。

向离心管内加入10ml完全培养液，吹打制成细胞悬液。

用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放入培养箱中培养。

06

细胞计数

细胞浓度以5×105/ml为宜。

07

培养细胞

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。

08

记录复苏日期

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注意事项

初学者易犯错误

结果分析

判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。

如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。

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